Metodi
Tutte le analisi sono basate sull’utilizzo della tecnica di reazione a catena della polimerasi (PCR). Per l’identificazione effettuiamo il sequenziamento di un frammento di DNA appartenente al gene codificante per la subunità I della citocromo ossidasi negli insetti (COI) (Brunner und Frey 2002). La sequenza così ottenuta può venire usata anche in studi di genetica di popolazione (Brunner et al. 2004), anche se questi ultimi vengono però solitamente effettuati con l’aiuto di marcatori di tipo microsatellite (Brunner und Frey 2004, Pfunder und Frey 2005). Nei casi nei quali è necessario analizzare un grande numero di campioni, sviluppiamo protocolli di Real-time PCR che permette di evitare procedimenti laboriosi come l’elettroforesi su gel. La Real-time PCR viene utilizzata anche quando si rende necessaria la quantificazione di un gene, come nel caso dell’analisi dei livelli di eteroplasmia nelle malerbe (Frey und Frey 2005). L’utilizzo di microarrays è stato sviluppato per semplificare diagnosi complicate e/o analisi in multiplex (Pfunder und Frey, 2004, Pfunder et al. 2004, Deyong et al. 2004). Questa tecnica è basata sull’ibridazione di DNA ad oligonucleotidi immobilizzati su una matrice e la rilevazione avviene grazie a sonde marcate con un colorante fluorescente o metallico (oro, argento).
Materiali ed apparecchiature da laboratorio
Il nostro laboratorio è completamente attrezzato per lo svolgimento di protocolli di biologia molecolare basati sulla PCR, tra i quali sequenziamento, analisi dei frammenti, utilizzo di microarray o tecniche di clonaggio. Disponiamo di 8 termociclatori (Perkin-Elmer, Techne) per utilizzabili fino a 96 reazioni incluso un termociclatore a gradiente (Mastercycler gradient, Eppendorf), un robot per il pipettaggio (epMotion 5075, Eppendorf), un robot per la purificazione del DNA a mezzo di particelle magnetiche (BioSprint 96, Qiagen), un sequenziatore a 16 capillari (3130xl Genetic Analyzer, Applied Biosystems), un apparecchio per la Real-time PCR (7500, Applied Biosystems), una macchina per concentrare di DNA (5301, Eppendorf), apparecchiature per la quantificazione del DNA (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, ND-3300 Fluorospectrometer, Witec), ), e la separazione e visualizzazione del DNA in gel (UV light cabinet, AlphaInnoTech). Per l’analisi dei microarrays disponiamo di uno spotter automatico che permette sia le tecniche di “solid” che di “split pin spotting” (QArray Mini, Genetix), una stazione automatica di ibridazione dei vetrini (SlidePro, GE-Amersham), e di due lettori, uno per segnali a fluorescenza (GenePix 4100A) e l’altro per sonde marcate con argento oppure oro (HiLight Reader, Invitrogen)
